基因編輯技術是一種能夠對生物體的基因組及其轉錄產物進行定點修飾或者修改的技術。CRISPR/Cas這項明星技術自問世以來，已經吸引了無數歡呼和掌聲。CRISPR/Cas系統為細菌與古細菌中抵御外源病毒和質粒DNA入侵的獲得性免疫機制系統。作為一種新型的基因組編輯技術，具有設計簡單、特異性強、效率高等優點。

CRISPR/Cas系統可以分為兩類：第一類系統的核酸酶由多個亞基組成；第二類系統特別受關注，其核酸酶由單一的蛋白組成，包括基于Cas9、Cas12和Cas13效應蛋白的II、V和VI型。其中最熟悉的 Cas9 蛋白廣泛用于基因組編輯等工作，但是CRISPR-Cas9系統也有它的不足之處，即脫靶效應。

CRISPR 蛋白家族中的 Cas13 可以靶向RNA 進行基因編輯，其專注靶向RNA的功能補充了靶向DNA的CRISPR-Cas9系統。目前已經發現 Cas13a（ 也被稱為 C2c2）、Cas13b、Cas13c 和 Cas13d 這 4 種蛋白都具有該功能。上述蛋白由于具有 RNA 結合特性，從而被發展成為核糖核酸的檢測器。

在中國科學院等最新發布的《2019研究前沿》報告上，“Cas13”入選生物科學領域TOP 10熱點前沿。

Cas13發現及發展過程

2016年6月：張峰團隊發明靶向RNA的全新CRISPR系統

張鋒博士是近幾年大熱的CRISPR/Cas9技術的先驅開創者之一。在改良及進一步操控CRISPR/Cas9這一工具加速基因組研究的同時，張鋒課題組也在尋求進一步擴大基因組編輯的工具箱。

2016年6月2日，美國麻省理工學院和麻省理工學院-哈佛大學博德研究所的張鋒等在《Science》發文，揭示 C2c2 是第一個只靶向RNA而不是DNA的新型CRISPR系統。論文標題為“C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector[1]”。

C2c2作用機理

C2c2專注靶向RNA的功能補充了靶向DNA的CRISPR-Cas9系統。如果說DNA是建構細胞形態和功能的“藍圖”，那么RNA就是將“藍圖”變為現實的“工程師”。因此，通過C2c2系統高通量地對RNA進行調控和改造，可實現對于基因功能在更廣泛層面上的調節。這對于疾病的研究和防治均具有深遠的意義。

該發現入選《Science》刊登的 20 項 2016 年最有意義的科研發現。

2016年9月：Jennifer Doudna團隊擴大了C2c2的用途

隨后，2016年 9 月，Jennifer Doudna 團隊又擴大了C2c2蛋白的用途，發現 C2c2 有兩種不同的 RNA 切割活性，而不是像先前研究中描述的只有1種。這兩種不同的RNA切割活性有各自的功能：第一種是負責生產導向RNAs，使C2c2能夠找到特定靶向的RNA分子；第二種是充當普通的RNA“剪刀”，用來破壞RNAs。

Jennifer Doudna團隊的研究以“Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection”[2]為題發表在9月26日的Nature雜志上。

2017年：王艷麗研究組等對 Cas13a 蛋白及其復合物進行了結構解析及機制分析

2017年，中國科學院生物物理所王艷麗研究組等對 Cas13a 蛋白及其復合物進行了結構解析及機制分析。王艷麗的研究組在2016年就開始利用結構生物學的方法研究Cas13a的結構和機理，并在2017年先后發表了兩篇《Cell 》文章，闡明了不同來源的Cas13a結構。

2017年1月12日，Cell 雜志發表了王艷麗課題組關于Ⅵ型CRISPR-Cas系統的效應蛋白C2c2的結構研究。標題為“Two Distant Catalytic Sites Are Responsible for C2c2 RNase Activities”[3]。

LshC2c2-crRNA的二元復合物的晶體結構

該研究解析了Leptotrichia shahii（Lsh）細菌中C2c2與crRNA （CRISPR-RNA） 的二元復合物以及C2c2在自由狀態下的晶體結構，揭示了LshC2c2通過兩個獨立的活性結構域來發揮其兩種不同的RNA酶切活性，這為研究C2c2發揮RNA酶活性的分子機制提供了重要的結構生物學基礎。

2017年7月27日，Cell雜志在線發表了王艷麗組和章新政組在VI型CRISPR-Cas系統效應蛋白Cas13a（亦稱C2c2）結構研究中取得的新進展。標題為“The Molecular Architecture for RNA-Guided RNA Cleavage by Cas13a. Cell[4]”。

LbuCas13a-crRNA-target RNA三元復合物的晶體結構

該研究成功解析了Leptotrichia buccalis （Lbu）細菌中Cas13a與crRNA （CRISPR-RNA）及其target RNA三元復合物3.08?的晶體結構、Cas13a與crRNA二元復合物3.2?的電鏡結構。研究結果證實target RNA的結合導致LbuCas13a的兩個HEPN（發揮RNA干擾功能的結構域）結構域發生構象變化，從而激發LbuCas13a非特異性地切割任意單鏈RNA的酶切活性。該成果為研究Cas13a發揮RNA酶活性的分子機制提供了重要的結構生物學基礎。

2017年2月：張峰團隊又發現了兩個新型的 RNA 靶向 CRISPR系統Cas13b 和 Cas13c

2017年2月16日，Molecular Cell雜志上刊登了張峰研究組的新成果。張鋒的研究小組利用一種數據挖掘方法，又發現了兩個新型的 RNA 靶向 CRISPR系統 Cas13b 和 Cas13c。論文標題為“Cas13b Is a Type VI-B CRISPR-Associated RNA-Guided RNase Differentially Regulated by Accessory Proteins Csx27 and Csx28[5]”

兩個新型的 RNA 靶向 CRISPR系統

研究發現，Cas13b具有靶向和編輯RNA的能力。僅靶向RNA的這一能力使得研究人員能夠以高通量地方式特異性地操縱RNA，從而用于研究廣泛的生物過程。

像Cas13a一樣，Cas13b僅需要單個向導RNA就能找到靶標，并且從遺傳學的角度是可編碼的。此外，Cas13b能夠同時靶向多個RNA轉錄本。但Cas13b也有一些獨特的特點，表明它與Cas13a是不同的。這些特性使得Cas13b更適用于微調基因功能。

2017年4月：張峰等開發基于CRISPR/Cas13a的診斷平臺

CRISPR除了“基因魔剪”身份外，還是一種高效、簡便、低廉的分子診斷工具。2017 年 4 月，張鋒團隊和 Jim Collins 團隊等基于靶向 RNA 的 CRISPR-Cas13a/C2c2，開發的一種高度靈敏的檢測器 ---“SHERLOCK”，可對特定病原體的核酸進行檢測。

相關研究結果于2017年4月13日在線發表在Science期刊上，論文標題為“Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2[6]”。

想用CRISPR 技術來治療人類的疾病，光靠 DNA 編輯是不夠的。因為不少疾病的根源在于 RNA。SHERLOCK的應用場景很廣泛。它非但可以檢測病毒感染和細菌感染，還可以“偵查”到耐藥基因、癌細胞的突變。目前該系統已成功用于寨卡病毒和登革熱病毒不同菌株的檢測。

2018年2月：一日兩篇《Science》展示Jennifer Doudna和張峰基于 CRISPR 系統開發的全新診斷工具

2018年2月15日，《科學》雜志在線發表兩篇重磅文章，一篇為麻省理工著名學者張鋒實驗室的關于升級版基因突變檢測技術“Sherlock V2”；另一篇為競爭如果對手加州大學伯克利分校的杜德拉教授團隊開發的基于Cas12a（又叫Cpf1）的新的基因突變檢測技術。

張鋒團隊：Sherlock v2 靈敏度提高100倍，可檢測多種病毒

SHERLOCK 試紙檢測結果展示

V2版結合了其他的Cas酶，實現同時檢測4種不同類型的病毒或者突變，而且信號靈敏度也大大提高。論文標題“Multiplexed and portable nucleic aciddetection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6.[7]”

Doudna 團隊：100%準確檢測出 HPV 16 感染

DETECTR 工作原理

Doudna 團隊使用的是 CRISPR-Cas12a 系統。他們發現一個很有趣的現象：這種 CRISPR 系統在剪切靶向的雙鏈 DNA 的同時，Cas12 的 DNA 酶活性會被激活，而該酶能非特異性切割單鏈 DNA（ssDNA）。論文標題：“CRISPR-Cas12a target binding unleashesindiscriminate single-stranded DNase activity.[8]”

2018年3月：Konermann等發現CRISPR新工具Cas13d

2018年3月15日，美國Salk研究所的Konermann等人在《Cell》在線發表一篇基因編輯重磅文章，分離出一種CRISPR-Cas蛋白新成員，屬于Type VI-D型，叫做Cas13d，其能夠有效地精準靶向降解RNA，在很多方面顯示出比Cas13a更加強大的功能。論文標題“Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors[9]”。

該研究的示意圖

Cas13d是一種來自腸道細菌（黃化瘤胃球菌XPD3002）的CRISPR/Cas系統，被命名為CasRx。同Cas13類似，CasRx能夠特異性的靶向并切割RNA，但比其他Cas13分子量小20%。同時CasRx介導的敲低效果相對于其他RNA調控方法具有更高的效率和特異性。

2018年9月：首次解析出CRISPR-Cas13d的三維結構

2018年9月20日的Cell期刊上，美國沙克生物研究所的研究人員首次解析出CRISPR-Cas13d的詳細分子結構。論文標題為“Structural Basis for the RNA-Guided Ribonuclease Activity of CRISPR-Cas13d”[10]。

CRISPR-Cas13d的三維結構

研究人員通過讓CRISPR-Cas13d在不同的動態狀態下凍存，并利用cryo-EM解析出這種酶的新的結構細節，從而能夠破解它的一系列活性，而不是僅在一個時間點觀察到一種活性。

2019年10月：張鋒團隊再造三合一組合抗病毒的新型CRISPR Cas13系統

2019年10月10日，Molecular Cell 雜志發表了張鋒研究組新進展。研究人員將Cas13的抗病毒活性及其診斷能力結合在一起，構建出一種未來有望用于診斷和治療病毒感染的系統。他們的系統稱為CARVER（Cas13輔助的病毒表達和讀出限制）。論文標題為“Programmable Inhibition and Detection of RNA Viruses Using Cas13[11]”。

CARVER平臺能將Cas13介導的病毒RNA裂解與基于Cas13的快速診斷讀數結合起來，使用特定的高靈敏度酶報告分子解鎖（SHERLOCK）平臺，檢測消滅基于RNA的病毒。

實驗流程

這項新的研究是首批利用Cas13或任何CRISPR系統作為體外培養的人細胞中的一種抗病毒劑的研究之一。

2019年11月：陳玲玲組使用CRISPR-Cas13系統應用于RNA活細胞標記

2019年11月19日，中國科學院分子細胞科學卓越創新中心（生物化學與細胞生物學研究所）陳玲玲研究組在Molecular Cell雜志上在線發表了關于CRISPR-Cas13應用于RNA活細胞標記的最新研究進展。論文標題為：“Dynamic imaging of RNA in living cells by CRISPR-Cas13 systems[12]”。

CRISRP-dCas13 在活細胞RNA標記上的應用

該研究對多種CRISPR-Cas13蛋白進行酶活突變后，篩選出了具有較好RNA標記能力的dPspCas13b和dPguCas13b蛋白，并且使用優化后的CRISPR-Cas13系統可以對胞漿和胞核的非編碼RNA和mRNA進行有效標記。進一步聯合dPspCas13b和dPguCas13b蛋白實現了對活細胞內不同RNA的雙色標記，與CRISPR-Cas9聯用實現了對轉錄RNA和基因位點同時標記。

Cas13核心研究團隊及機構

據中國科學院等最新發布的《2019研究前沿》報告顯示，Cas13研究前沿中施引論文的 Top 產出國家前三分別是美國、中國和德國。Top機構包括：哈佛大學、美國國家衛生研究院、中科院、麻省理工學院等。

Cas13研究前沿中施引論文的 Top 產出國家和機構

在 CRISPR 的研究上，有兩個先鋒人物是不得不提，那就是麻省理工學院教授張鋒和加州大學伯克利分校教授Jennifer A. Doudna。

▲Jennifer A. Doudna（左）和張鋒（右）

張峰團隊

張鋒博士是近幾年大熱的CRISPR/Cas9技術的先驅開創者之一。張鋒，2004年畢業于哈佛大學化學物理專業；2009年取得斯坦福大學化學與生物工程博士；2011年加入美國麻省理工學院（MIT）。

2013年，這位80后的年輕華人科學家開發出了可用來編輯DNA、敲除指定基因的CRISPR/Cas系統，自此之后一直致力于推動這一技術走向完美。

2017年1月成為麻省理工學院理學院（School of Science）的終身教授，成為麻省理工史上最年輕華人終身教授。

2019年3月，Collins、張鋒等成立了Sherlock Biosciences公司，專注開發新型診斷/檢測技術，用于多種不同的領域。4月，新銳公司Sherlock Biosciences宣布獲得額外投資，A輪融資金額提高到了4900萬美元。

Jennifer Doudna團隊

加州大學伯克利分校的生物化學家Jennifer A. Doudna教授是基因組編輯技術變革的先驅之一，其帶領的研究團隊取得了諸多令人側目的CRISPR研究成果。

據Doudna實驗室官網顯示，僅2016年，研究小組就在Cell、Nature、Science、Nature Biotechnology 、Nature Methods等雜志上發表論文近三十篇。

參考論文：

1.Abudayyeh, O. et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. Online First: June 2, 2014.

2.Nature：Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection

3.Two distant catalytic sites are responsible for C2c2 RNase activities Cell， 168（1）， 121-134.

4.Liang Liu, Xueyan Li, Jun Ma et al. The Molecular Architecture for RNA-Guided RNA Cleavage by Cas13a. Cell, Published Online: July 27, 2017, doi:10.1016/j.cell.2017.06.050

5.Aaron A. Smargon， David B.T. Cox， Neena K. Pyzocha， et al.Cas13b Is a Type VI-B CRISPR-Associated RNA-Guided RNase Differentially Regulated by Accessory Proteins Csx27 and Csx28.Molecular Cell.January 5， 2017.

6.Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2

7.Multiplexed and portable nucleic aciddetection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6.

8.CRISPR-Cas12a target binding unleashesindiscriminate single-stranded DNase activity.

9.Konermannet al.,Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors, Cell （2018），https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.02.033

10.Cheng Zhang, Silvana Konermann, Nicholas J. Brideau et al. Structural Basis for the RNA-Guided Ribonuclease Activity of CRISPR-Cas13d. Cell, 20 Sep 2018, 175（1）：212-223, doi:10.1016/j.cell.2018.09.001.

11.Catherine A.Freije et al. Programmable inhibition and detection of RNA viruses using Cas13. Molecular Cell, Published Online: 10 October 2019, doi:10.1016/j.molcel.2019.09.013.

12.Yang LZ, Wang Y, Li SQ, Yao RW, Luan PF, Wu H, Gordon G. Carmichael, Chen LL. Dynamic Imaging of RNA in Living Cells by CRISPR-Cas13 Systems. Mol Cell .2019 Nov 19. pii: S1097-2765（19）30802-0. doi: 10.1016/j.molcel.2019.10.024.

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轉發來源：賢集網